Виварий и 3R: как ВГНКИ проводит доклинические исследования ветпрепаратов

Сначала — карантин и адаптация

— Гелла Владимировна, у ВГНКИ есть несколько вивариев. Расскажите, пожалуйста, какова их вместительность?

— Действительно, на базе ВГНКИ есть несколько вивариев, адаптированных как для содержания мелких лабораторных животных, так и для целевых видов: продуктивных и непродуктивных животных — собак, кошек, телят, поросят, сельскохозяйственной птицы.

Одномоментно в виварии для лабораторных животных можно разместить до 500 крыс, до 1 тыс. мышей. Сельскохозяйственные животные размещаются в отдельных вивариях, где одномоментно может содержаться до 50 поросят и телят, до 500 голов птицы.

Большинство исследований, проводимых с использованием целевых видов животных, продолжаются в аналитической лаборатории, где изучаются концентрации действующих веществ в биологическом материале, полученном от этих животных.

— Виварий — это проект, требующий, по сути, стерильности. Какие сегодня есть требования биобезопасности, как они реализованы у вас?

— Виварии спроектированы в соответствии с соблюдением правил «поточности». Сначала все животные попадают в зону карантинирования, где они проходят карантин и адаптацию от 7 до 30 суток. Далее животных переводят в боксы содержания, где они будут находиться во время исследований.

Все поступающие для исследования животные проходят строгий ветеринарный контроль: ветеринарные врачи базы проверяют ветеринарно-сопроводительную документацию на правильность и полноту оформления данных, проводится клинический осмотр и взвешивание вновь поступивших животных.

Виварии оснащены системой санпропускников, обеспечивающих биологическую безопасность как для животных и сотрудников, так и для окружающей среды. Система вентиляции и канализации имеет фильтры для обеспечения биологической безопасности окружающей среды.

— Каковы условия содержания и ухода?

— После карантинирования и переведения в постоянные места содержания для постановки в опыт все животные минимум три дня проходят период адаптации к новым условиям содержания. Сотрудники, которые будут работать с этими животными (исследователи, лаборанты) ежедневно проводят хедлинг, то есть приучают животных к рукам, зонду — в случае планированного внутрижелудочного введения, к исследователю.

В нашем виварии просторные клетки, для крыс имеются туннели и места для гнездования, для кошек и собак оборудованы лежанки, есть игрушки.

Уборка помещений содержания животных проводится ежедневно, после окончания манипуляций с животными. Каждый бокс оснащен своим уборочным инвентарем, уборка проводится с использованием нетоксичных уборочных средств.

Температура содержания животных контролируется логгерами. Оптимальная температура содержания грызунов — +20…+24 °С, оптимальная влажность — 45–65%. Контроль температуры и влажности фиксируется в листах учета влажности и температуры два раза в сутки. Для снижения стресса в виварии предусмотрен режим день/ночь — 12/12. Виварий оснащен замкнутой системой вентиляции с хепа-фильтрами, обеспечивающей приток воздуха и поддержание температуры.

Принципы биоэтики

— Исследование на животных — очень чувствительная тема. Какие меры этики применяются при проведении исследований?

— Мы придерживаемся принятых в международном научном сообществе подходов, направленных на гуманное использование животных в науке. Общепризнана концепция трех R: replacement (замена), reduction (сокращение), refinement (совершенствование). Причем сейчас этот принцип претерпевает эволюцию к 4R и далее, эксперты добавляют новые R. Например:

• responsibility (ответственность), что подчеркивает моральную ответственность ученого;
• rehabilitation (реабилитация), это применимо к целевым животным, особенно к собакам и кошкам, и другим высокоорганизованным животным, которых после исследований пытаются пристроить в спецприюты.

— А как на практике выглядит такой подход?

— В наших вивариях используются альтернативные методы исследований, например культуры бактерий, дрожжей или культуры клеток для изучения мутагенности. Моделируем сроки выведения остаточных количеств действующих веществ лекарственных препаратов с помощью программы математического моделирования. Это позволяет уменьшить количество продуктивных животных в опыте.

Для оценки острой токсичности препаратов, в состав которых входят хорошо изученные действующие вещества, — например, мы используем минимально достаточное для статистической обработки полученных данных, животных.

Мы стараемся научно обоснованно совершенствовать дизайн эксперимента таким образом, чтобы количество животных в эксперименте было минимально достаточным для получения статистически достоверных данных. Все болезненные манипуляции с животными проводятся с использованием газового наркоза, для чего в отделе имеется наркозный аппарат для лабораторных и непродуктивных животных — мышей, крыс, морских свинок, кроликов, собак и кошек.

При работе с продуктивными животными при проведении отдельных манипуляций мы используем парентеральный наркоз. Однако его применение должно быть строго регламентировано и исключать действие наркозных препаратов на результаты токсикологических исследований изучаемого лекарственного препарата.

Нами используются некоторые малоинвазивные методики, например методика взятия капель крови из орбитального синуса у мышей или из кончика хвоста у крыс вместо достаточно болезненной венопункции при проведении биохимических и гематологических исследований крови.

Все специалисты, работающие с животными, имеют высокую квалификацию в обращении с животными и проведении процедур.

— Какие международные и российские методики используются для оценки токсичности, фармакокинетики и специфических исследований (мутагенность, эмбриотоксичность, аллергизирующее действие)?

— Для воспроизведения методик мы используем как стандартные протоколы, описанные в Руководствах по проведению доклинических исследований под редакцией Р. У. Хабриева или Л. Н. Миронова, так и ГОСТы, гармонизированные с методиками OECD (стандартизированные международные руководства по проведению испытаний, разработанные Организацией экономического сотрудничества и развития. — «ВиЖ»). В каждом конкретном случае составляется план исследования, адаптированный под цели и задачи каждого конкретного случая, который согласовывается с заказчиком исследования.

— Как изучается токсичность, какие параметры при этом измеряются?

— Оценка острой токсичности — первый этап изучения безопасности лекарственного препарата. Согласно международным руководствам, вместо традиционного определения точного значения ЛД₅₀ для препаратов, в состав которых входят хорошо изученные действующие вещества, используются более гуманные и информативные методы:

• метод фиксированных доз;
• оценка острой токсичности по классам (Acute Toxic Class Method);
• модифицированный тест ЛД₅₀ (Up-and-Down Procedure).

В нашем отделе мы, конечно, изучаем острую токсичность классическим методом по заявлению заказчика, однако в большинстве случаев мы определяем класс токсичности одним из вышеперечисленных методов. Тем более что практически все препараты в настоящее время имеют в своем составе хорошо изученные молекулы действующих веществ.

При изучении хронической токсичности стандартно мы оцениваем такие параметры, как динамика веса, биохимические и гематологические анализы крови в динамике, исследования мочи, метаболизм, состояние органов после применения препарата. Проводится оценка восстановления организма после отмены препарата в динамике.

В каждом индивидуальном случае в зависимости от состава и изученности действующих веществ при составлении плана исследования мы можем дополнить перечень контролируемых параметров физиологическими тестами, ЭКГ, УЗИ и другими исследованиями, провести более развернутые и углубленные исследования крови, мочи и микроскопические исследования органов.

Как создается программа исследований

— Гелла Владимировна, расскажите, как формируется программа доклинических исследований?

— Мы составляем программу доклинических исследований для конкретного препарата на основе проекта инструкции и данных научных исследований. В ней описываются все необходимые для доказательства безопасности доклинические исследования, а также цель, обоснование, количество животных, распределение по группам, путь, кратность и доза введения, требования к аналитическим методам, необходимые контролируемые параметры у животных.

— От чего обычно зависит стоимость исследований?

— В основном от вида животных и длительности их содержания. Что касается исследований с разработкой и валидацией методик, а также проведения аналитических исследований органов, тканей и сыворотки крови (изучение фармакокинетики и сроков выведения), в этом случае стоимость исследований зависит также от состава препарата и количества действующих веществ и их активных метаболитов.

— Насколько быстро можно запустить программу исследований и получить результаты для подачи на регистрацию?

— Как правило, проведение доклинических исследований одного препарата, в зависимости от изученности действующих веществ и количества необходимых исследований — общая и специфическая токсичность, переносимость, ФК, сроки выведения — занимает от года до пяти лет.

— Возможна ли при необходимости адаптация программы исследований под требования зарубежных регуляторов?

— Все протоколы исследований, проводимых в нашем отделе, разрабатываются в соответствии с поставленными целями и задачами. За основу могут быть взяты как стандартные методики, описанные в руководствах, так и ГОСТы, гармонизированные с методиками OECD (для лабораторных животных), так и при изучении, например, переносимости, фармакокинетики или сроков выведения действующих веществ препаратов за основу мы принимаем рекомендуемые методики VICH, EMA, CVMP. В каждом конкретном случае при планировании исследования мы руководствуемся принципом научного подхода с целью доказательства безопасности и эффективности исследуемого лекарственного средства.